篇一 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告4450字
關(guān)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
劉希偉201100140041分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
質(zhì)粒dna的提取、純化及檢測(cè)
姓名：___學(xué)號(hào)：2011001400__年級(jí)：20__級(jí)生物基地班 實(shí)驗(yàn)日期：2023年9月16日—30日組別：6組 同組者：__
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒dna的原理和方法。
2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行dna的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。
3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。
4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中dna的分離純化方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
1、質(zhì)粒dna的制備方法
質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈dna分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的dna。
質(zhì)粒dna的制備包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒dna大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒dna。主要方法包括：堿裂解法：0。2molnaoh+1%sds；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；sds裂解法：10%sds，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒dna的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇堿裂解法提取質(zhì)粒dna。
2、質(zhì)粒dna的提取——堿變性提取法
在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體dna和質(zhì)粒dna均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶ph值不同。在ph值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體dna的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。因?yàn)樗鼈冊(cè)谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用ph值4。6的kac（naac）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒dna可恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體dna不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子rna、蛋白質(zhì)—sds復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒dna分離。溶于上清液的質(zhì)粒dna，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于dna和rna性質(zhì)類似，乙醇沉淀
dna的同時(shí)，也伴隨著rna沉淀，可利用rnasea將rna降解。質(zhì)粒dna溶液中的rnasea以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒dna。
3、凝膠電泳進(jìn)行dna分離純化
電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定ph條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化dna的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。
凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中dna的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，eb）或sybr gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈dna在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話，這些分離的dna條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。
分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的dna都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行dna序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的dna上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀多聚物，由β—d—吡喃半乳糖與3，6—脫水—l—吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段dna（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定dna的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的dna的片段，進(jìn)一步純化dna等。
瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。dna在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個(gè)因素：樣品dna分子的大小、dna分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場(chǎng)、緩沖液和溫度。
三、實(shí)驗(yàn)材料
1、實(shí)驗(yàn)儀器
培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（eppendorf管）、高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號(hào)槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號(hào)筆、手套等。
2、實(shí)驗(yàn)試劑
lb培養(yǎng)基，抗生素ap（氨芐青霉素），溶液ⅰ，溶液ⅱ，溶液ⅲ，rnasea母液，te緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（pci）混合液，預(yù)冷無水乙醇，tae電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（eb），dna相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物dna marker λ/hind ⅲ，5mol/l ph 5。2的醋酸鈉。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)
配制lb液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配lb固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個(gè) ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。
2、菌體培養(yǎng)
在含有ap的lb平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒puc19的e。coli dh5單菌落，接種于20mllb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加ap100ul
（100ug/ml），質(zhì)粒puc19具有ap抗性基因，使得帶有puc19的質(zhì)粒得以生長(zhǎng)。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，生長(zhǎng)速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。
3、質(zhì)粒提取
（1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。
（2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。
（3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液ⅰ中的葡萄糖使
溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止dna受機(jī)械剪切力作用而降解。edta是ca2+和mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制dnase的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)。tris—cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒h。
（4） 按比例加入新配制的溶液ⅱ2ml（與溶液ⅰ對(duì)應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液ⅱ中的naoh使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時(shí)，強(qiáng)堿性使染色體dna、質(zhì)粒dna和蛋白質(zhì)變性；sds為下一步沉淀做鋪墊。
（5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液ⅲ1。5ml（與溶液ⅰ、ⅱ對(duì)應(yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)sds復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液ⅲ中的hac中和naoh，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷基因組dna，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被pds共沉淀。同時(shí)變性的質(zhì)粒dna復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。
（6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3mnaac混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)dna很安全，因此是理想的沉淀劑。 dna溶液是dna以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去dna周圍的水分子，使dna失水而易于聚合。在ph為8左右的溶液中，dna分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的naac或nacl，易于互相聚合而形成dna鈉鹽沉淀。
（7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到dna沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。
（8）以12000rpm離心5min，離心管底部dna沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。
（9）將dna沉淀溶于1mlte緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)eppendorf管中。te是ph緩沖液，為dna提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)。同時(shí)含有edta是二價(jià)陽離子的螯合劑，抑制dna酶作用。
4、質(zhì)粒純化
（1）eppendorf管中加入rnase a（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h
（2）將上述的溶液平均分配到2個(gè)1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的eppendorf管中。苯酚是經(jīng)tris飽和后的，顯黃色。苯
酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。
（3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的eppendorf管中。苯酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會(huì)影響dna的酶切，它本身易被氧化，會(huì)損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時(shí)溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。
（4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的eppendorf管中，得上清液400ul。
（5）向上清液中加入1/10體積的naac混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。
（6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到dna沉淀，為白色。
（7）向dna沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部dna沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。
（8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulte溶解于1管中。
5、質(zhì)粒檢測(cè)
（1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×tae電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補(bǔ)充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。
（2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×tae 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。
（3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。
（4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)eb溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。
（5）凝膠成像儀觀察。
五、注意事項(xiàng)
（1）滴加溶液ii時(shí)，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動(dòng)作要快，因?yàn)閺?qiáng)堿在溶液中停留時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)破壞質(zhì)粒dna。
（2）加入溶液iii后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液iii中和強(qiáng)堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體dna斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。
篇二 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告模板550字
實(shí)驗(yàn)名稱：用高倍顯微鏡觀察葉綠體和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1.初步掌握高倍顯微鏡的使用方法。
2.觀察高等植物的葉綠體在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的形態(tài)和分布
二、實(shí)驗(yàn)原理
高等植物的葉綠體呈橢球狀，在不同的光照條件下，葉綠體可以運(yùn)動(dòng)，改變橢球體的方
向，這樣既能接受較多的光照，又不至于被強(qiáng)光灼傷。在強(qiáng)光下，葉綠體以其橢球體的側(cè)面朝
向光源;在弱光下，葉綠體以其橢球體的正面朝向光源。因此，在不同光照條件下采集的葫蘆
蘚，其小葉內(nèi)葉綠體橢球體的形狀不完全一樣。
活細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)，可以用細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的
葉綠體的運(yùn)動(dòng)做為標(biāo)志。
三、材料用具
蘚類的葉，新鮮的黑藻，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，滴管，鑷子，刀片，培養(yǎng)皿，鉛筆
四、實(shí)驗(yàn)過程（見書ｐ30）
1．制作蘚類葉片的臨時(shí)裝片
2．用顯微鏡觀察葉綠體
3．制作黑藻葉片臨時(shí)裝片
4．用顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)
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五、討論
1．細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的葉綠體是否靜止不動(dòng)，為什么？
2．葉綠體的形態(tài)和分布與葉綠體的功能有什么關(guān)系？
3．植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)，這對(duì)于活細(xì)胞完成生命活動(dòng)有什么
意義？
4．用鉛筆畫一個(gè)葉片細(xì)胞，標(biāo)出葉綠體的大致流動(dòng)方向。
篇三 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告500字
微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文
實(shí)驗(yàn)名稱：用高倍顯微鏡觀察葉綠體和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1.初步掌握高倍顯微鏡的使用方法。
2.觀察高等植物的葉綠體在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的形態(tài)和分布
二、實(shí)驗(yàn)原理
高等植物的葉綠體呈橢球狀，在不同的光照條件下，葉綠體可以運(yùn)動(dòng)，改變橢球體的方向，這樣既能接受較多的光照，又不至于被強(qiáng)光灼傷。在強(qiáng)光下，葉綠體以其橢球體的側(cè)面朝向光源;在弱光下，葉綠體以其橢球體的正面朝向光源。因此，在不同光照條件下采集的葫蘆蘚，其小葉內(nèi)葉綠體橢球體的形狀不完全一樣?；罴?xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的`流動(dòng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)，可以用細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的葉綠體的運(yùn)動(dòng)做為標(biāo)志。
三、材料用具
蘚類的葉，新鮮的黑藻，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，滴管，鑷子，刀片，培養(yǎng)皿，鉛筆
四、實(shí)驗(yàn)過程（見書ｐ30）
1．制作蘚類葉片的臨時(shí)裝片
2．用顯微鏡觀察葉綠體
3．制作黑藻葉片臨時(shí)裝片
4．用顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)
五、討論
1．細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的葉綠體是否靜止不動(dòng)，為什么？
2．葉綠體的形態(tài)和分布與葉綠體的功能有什么關(guān)系？
3．植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)，這對(duì)于活細(xì)胞完成生命活動(dòng)有什么意義？
4．用鉛筆畫一個(gè)葉片細(xì)胞，標(biāo)出葉綠體的大致流動(dòng)方向。
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